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2019
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07
细菌总数检验方法
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细菌总数检验方法
一、国标法：采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是一种测定水中好氧的和兼性厌氧的异养细菌密度的方法，由于细菌在水体中能以单独个体、成对、链状，成簇或成团的形式存在，此外没有单独的一种培养基或某一环境条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求，所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。细期总数是指1毫升水样在营养琼脂培养基中，37℃、24小时培养后所生长的菌落数。一般规定，1毫升自来水中总菌数不得超过100个。
1.方法和步骤
（1）采集水样。
（2）吸取10 ml水样（河水、污水、游泳池水或港湾水等），注入盛有90ml无菌水或无菌海水的三角瓶中，混匀成10-1稀释液，在吸水样前，水样应彻底搅动均匀。
（3）按10倍稀释法将水样稀释成10-2、10-3、10-4。
（4）根据水样的洁净程度，污染严重者选取10-2、10-3、10-4稀释度；中等的选取10-1、10-2、10-3稀释度，每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿1ml。稀释度的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平皿上菌落总数介于30—300个之间。
（5）注入彻底融化，然后冷却到45℃的营养琼脂培养基约15ml，立即旋摇培养血，充分混匀，水平放置至固化。
（6）接种河水的培养皿，倒置于37℃培养24小时。
2.结果与分析
取同一稀释度的平板培养物，依菌落计算原则进行计算。
（1）菌落计算原则
平皿菌落的计算，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，防止遗漏，也可借助于菌落计数器计数。对长得相当接近，但不相触的菌落，应予以—一计数。对链状菌落，应当作为一个菌落来计算。平皿中若有较大片状菌落时则不宜采用，若片状菌落少于平皿的一半时，而另一半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。算出同一稀释度的平均菌数，供下一步计算时用。
（2）计算方法
①首先选择平均菌落数在30～300者进行计算。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可用它作为平均值乘其稀释倍数。
②若有两个稀释度的平均菌落数都在30—300之间，则应按两者的比值来决定。若其比例小于2，应报告两者的平均数；若大于2，则报告其中较小的数字。
③如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
⑤如果全部稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
③菌落计数的报告，菌落在100以内时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示
3注意事项
（1）试验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。
（2）用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿吸管或空气可能存在的污染。
（3） 检样的稀释液虽可用灭菌盐水或蒸馏水，但以用磷酸缓冲盐水特别是0.1％蛋白胨水为合适，因蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释，则需采用蒸馏水。
二、快速检测新技术
1.3M测试片快速分析技术
①1 3M测试片快速分析技术概念
3M测试片法是一种便捷可再生水化干膜，适用于细菌和真菌的计数。
②结果判读
1）测试片中含有一种红色指示染剂可使菌落着色，计算所有红色菌落(不论其大小和颜色深浅均计算之)。
2）测试片菌落数适宜计数范围是25-250。
3）测试片面积约为20平方厘米，当菌落数超过250个，为了估计菌落数，可选择其中一个或数个有代表性菌落的小方格(1cm2)，计算平均菌落数，再乘以20可得到整个测试片上的菌落数。
4）有很多高数量菌落，使整个生长区变粉色，应计录为菌落太多无法计数。
5）有时菌落分布出现不均衡，,这也记录为菌落太多无法计数。
6）测试片上的菌落,最先粗略一看是可计数的，然而，你密切注意到生长区边缘，能看到高密度的菌落，应记录为菌落太多无法计数。
3 测试片法特点
1）工作效率的极大提高
2）品质稳定的快速测试片克服了传统的测试方法存在的由于使用不同批次的培养基，不同的配制条件，不同配制人员而导致的差异性。
2.ATP法
1）荧光法检测总菌落数原理
萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂—荧光素酶、虫荧光素(D-luciferin)以及所有细胞生物都产生的生物能量物质—三磷酸腺苷（ATP）。在有氧的条件下，虫光素酶催化虫荧光素和ATP之间发生氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光。
3.MTT法
3.1 MTT法检测原理
检测原理为活体微生物线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，能使外源性MTT（噻唑蓝）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。Formazan结晶形成的量与活菌数成正比。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活菌细胞数量。
4.流式细胞术
1 流式细胞术检测原理
检测原理：细胞经特异荧光素标记后，通过激光照射，产生特异荧光信号，通过对这些荧光信号的检测和定量计算出菌群总数。
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